主页！[中信娱乐]！主页近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术、基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法大多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点逐渐满足不了科研的需求，因此，RACE技术应运而生，接下来，就让小V带大家去了解一下RACE技术吧!~

　　引物设计的优劣对于做RACE是至关重要的，如果引物的特异性不好，就会给实验带来许多麻烦，甚至扩增不到我们实验预想的目的产物，接下来小v就带大家看看RACE实验中需要用到的引物设计原则吧！

　　引物长度：23 - 28个核苷酸，建议不超过30个核苷酸；GC含量：50% - 70%；

　　Tm值：Tm≥65°C，Tm70°C使用Touch Down PCR有助于提高产物特异性；对于较长片段(10 kb)或丰度较低的待测转录本，GSP引物设计尽量靠近cDNA的末端(≤3 kb)；针对同一待测转录本可设计多条GSP，进行RACE扩增以提高成功率。

　　1.引物长度、GC含量、Tm值：同GSP设计原则；位置：NGSP须设计在GSP的3端，建议NGSP的5末端与GSP的3末端有5 - 15 nt的重叠，有助于提高二轮巢式扩增时的特异性。

　　2.如果上一轮 PCR 没有理想的特异产物（如无扩增产物、产物较弱、产物弥散），或者产物非特异条带过多、基因表达丰度低，巢氏PCR与RACE结合可以提高克隆的准确度，巢式引物结合在上一轮PCR产物的内部，进行PCR扩增可设计多轮巢式引物进行巢式PCR扩增。

　　友情提醒：巢式PCR可以提高扩增倍数，降低了非特异性反应连续放大进行的可能性，提高了实验的成功率。

　　➣ RNA提取物中无目的转录本或者目的转录本表达丰度低，可以设计已知转录本区域的qPCR或PCR引物进行目的产物检测；检测后发现表达丰度低，可以增加RNA模板投入量；

　　➣ RNA降解：进行试验前检测RNA的完整度，可以通过RNA琼脂糖凝胶电泳观察RNA的完整度；

　　➣ 设计Nested GSP，进行多轮巢式PCR（一般不超过3轮），富集产物片段同时保证了扩增产物特异性；

　　➣ 待扩增目的片段过长：提高PCR延伸时间，GSP设计时尽可能放在序列末端；

　　➣ 目的基因属于多基因家族，可以进行数据库对比，针对特异性区段序列设计GSP；

　　➣ 可能是RNA前体具有可变剪接形式，可以进行数据库对比，针对特异性区段序列设计GSP;

　　➣ 扩增非特异性：设计额外的NGSP，进行多轮巢式PCR，将目的产物进行胶回收，再次进行RCP扩增。

　　➣ 逆转录后设计已知序列的qPCR引物或PCR引物，扩增逆转后的cDNA，如果没有扩增说明没有cDNA或含量较低，建议使用随机引物进行逆转，同时选择多条GSP进行PCR；如果有扩增产物，说明逆转录没有问题，可以进行巢式PCR富集特异产物。

　　➣ 引物设计结果为空白，可能是没有符合要求的引物序列，可以排查一下引物GC含量，GC含量太低或太高都会产生影响。

　　➣ 测序结果多出3个G碱基是RACE过程中加上去的，对实验结果不会产生影响，软件比对时把多出的碱基删除为线) 克隆产物测序结果不同，如何判断哪个是全长序列？

　　➣ 转录本本身可能存在多种可变剪接形式，表明两个序列都是正确的。尽量在实验中尽可能地增加克隆数测序，减少实验中的误差。