首页！『万和城注册』！首页大豆是全球重要的经济作物，同时也是人类和动物可食用油脂和蛋白质的主要来源[1]。由于受到生物和非生物逆境胁迫的影响，大豆的品质和产量难以满足人们的需求。常规育种技术在品质改良和新品种选育方面发挥着重要作用，但育种周期长一直是该技术的瓶颈之一[2]。目前，备受关注的植物基因工程技术可定向改良植物的不良性状，大大缩短育种年限，进而提高经济效益，其中农杆菌介导的遗传转化技术是在作物育种和植物基因功能研究中最为广泛使用的技术，但在大豆中，遗传转化技术仍然是比较困难且耗时的，这也阻碍了大豆的高通量基因功能分析。因此，本研究通过开发由发根农杆菌（
1、挑选种皮完整的大豆种子放入干燥器中，然后在干燥器中放置一个烧杯（图1），向其中加入4mL的12M 盐酸和100mL含5.25%的次氯酸钠，混合以产生氯气[3]，盖紧干燥器的盖子，灭菌16h。
2、表面灭菌的大豆萌发后，用锋利的手术刀切除发芽种子的下胚轴末端，只留下三分之二的大豆子叶；然后，将受伤的子叶用农杆菌（K599）悬浮液侵染30min；最后，将子叶均匀的置于培养基上，在24℃条件下共培养5天（16h光照/8h黑暗）（图1）。此处的B5（伯远严选#RFC01）、1/2 B5、MS（伯远严选#RFA01）、1/2 MS基础培养基需要补充0.5g/L MES、2%蔗糖、0.7%琼脂、1.67mg/L 6-BA（伯远严选#RJN00）、0.25mg/L GA3和40mg/L乙酰丁香酮（pH=5.4）。
3、共培养后，将外植体转移至生根培养基（Rooting Medium，RM）上，置于24℃的黑暗培养箱中培养10天，诱导产生毛根（图1）。生根培养基即MS基础培养基辅以0.5g/L MES、2%蔗糖、200mg/L头孢噻肟（伯远严选#RJB00）（pH=5.7）。
1、通过比较不同培养基上共培养后大豆毛根的诱导情况（图2），可以观察到在1/2 B5和1/2 MS培养基上诱导的大豆离体毛根生长状况良好。GUS染色结果表明，与其他三种培养基相比，用1/2 B5培养基共培养后，诱导的大豆毛根转化效率最高，达到了53%。此外，毛根转化效率不受种子萌发时间的限制。因此，用萌发一天的大豆子叶在1/2 B5培养基上共培养效果最佳。
图2. 培养基和种子萌发时间对毛根转化效率的影响。a 将Williams 82接种农杆菌后在1/2 B5、MS、B5、1/2 MS培养基上共培养后诱导的毛根生长状态。b、e 转基因毛根GUS染色结果。c、f 转化率统计结果。d 使用萌发1天、2天、3天、4天、5天大豆子叶作为外植体诱导的毛根生长状态。
2、通过在生根培养基中添加不同浓度的除草剂（图3），可以观察到除草剂对非阳性毛根的生长具有抑制作用，当除草剂的浓度为3mg/L时，大豆离体毛根的转化效率最高，可以达到69%。因此，用萌发一天的大豆子叶在1/2 B5培养基上共培养后，用含有3mg/L除草剂的生根培养基诱导毛根效果最佳。
图3. 除草剂筛选对毛根生长和转化效率的影响。a Williams 82在含有不同浓度除草剂的MS培养基上的毛根生长状态。b 在含有不同浓度除草剂的MS培养基上生长的转基因毛根的GUS染色结果。c 在含有不同浓度除草剂的MS培养基上每个外植体的毛根总数。d 含有不同浓度除草剂的MS培养基上的阳性毛根转化率。
3、不同基因型大豆的毛根转化效率差异不显著（图4）。这表明，该转化体系具有广泛的适用性。
图4. 不同基因型大豆的毛根转化。a 用不同基因型大豆诱导的毛根的生长状态。b 来自不同基因型大豆的转基因毛根的GUS染色结果。c 不同基因型大豆的阳性毛根转化率。
通常通过质粒瞬时转化到水稻原生质体或通过根癌农杆菌介导的瞬时转化在烟草叶片中研究蛋白的亚细胞定位[4]。结合图5的拍照结果，可以清晰的观察到蛋白在大豆毛根细胞中的定位情况，这表明毛根转化体系能够用来评估大豆的蛋白表达和亚细胞定位。
图5. 在大豆毛根和烟草中观察蛋白亚细胞定位情况。a 大豆毛根（左）和烟叶（右）中GFP的表达和亚细胞定位情况。b 大豆毛根（左）和烟叶（右）中GFP-GmSKRP1融合蛋白表达和亚细胞定位情况。c 大豆毛根（左）和烟叶（右）中mCherry-CAAX融合蛋白表达和亚细胞定位情况。
GmNSF-YFPN和GmSNAP-YFPC在大豆毛根和烟草中共表达后，可以观察到明显的荧光信号（图6）。此外，基因在大豆毛根和烟草叶片细胞中的互作表达水平存在一些差异。这表明GmNSF和GmSNAP的互作可能在大豆中具有特殊的生物学作用。因此，毛根体系可以帮助科研人员更准确地预测大豆基因的实际功能。
对转基因毛根进行检测，使用特异性引物扩增靶基因，结果显示靶基因被成功编辑，出现了核苷酸缺失、插入或替换的各种情况。CRISPR/Cas9技术在大豆毛根中的平均编辑效率为53%。而在培养基中添加除草剂进行筛选后，毛根的平均编辑效率可以提升至72%（图7）。因此，毛根转化体系可以用于CRISPR/Cas9基因编辑靶标sgRNA的筛选。
图7. 大豆毛根的CRISPR/Cas9基因编辑。a 大豆Glyma06g14180基因结构和选定的sgRNA靶标。蓝色字符表示sgRNA，红色字符表示PAM序列，下划线字符表示Pst I酶切位点。b、c 凝胶电泳和测序分析。使用特异性引物扩增靶基因并结合凝胶电泳技术，对转基因毛根进行检测，结果显示，经过编辑后的毛根只有一个大条带。测序结果显示不同的突变类型。黄色字符表示突变序列。b 普通生根培养基培养的毛根样品的检测结果。c 含除草剂的生根培养基培养的毛根样品的检测结果。d 在生根培养基中添加除草剂对毛根编辑效率的影响。
