主页-新城娱乐_新城_login注册登录页面麸质由麦谷蛋白和麦醇溶蛋白组成，决定面团的粘弹性和小麦 ( Triticum aestivum L.)的最终使用质量。麦醇溶蛋白对小麦的最终用途性状很重要，但个别麦醇溶蛋白基因的贡献尚不清楚，因为麦醇溶蛋白由复杂的多基因家族编码，包括许多假基因。

　　我们使用 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑和基于图谱的克隆来研究小麦品种“Fielder”中注释的 γ-醇溶蛋白基因的贡献，表明 Gli-γ1-1D 和Gli - γ2-1B占大部分γ-麦醇溶蛋白的积累。

　　敲除突变体中只有两个 γ-麦醇溶蛋白基因的活性受损改善了最终使用质量并减少了与乳糜(CD) 相关的麸质表位。此外，我们确定了Gli-γ1-1D的优良单倍型，与小麦种质资源库中更高的最终用途质量相关，并为该等位基因开发了分子标记，用于标记辅助选择。

　　我们的研究结果为旨在提高小麦最终用途质量的基于生物技术的传统育种计划提供了信息和工具。

　　用于醇溶蛋白/谷蛋白相关分析、面粉加工质量分析和产量相关性状表型分析的小麦（Triticum aestivum L.）植物在试验田中生长。

　　我们使用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳（A-PAGE）评估了包含206个基因型的小麦种质资源中的醇溶蛋白谱，包括159个现代品种和47个地方品种。我们确定了与γ-醇溶蛋白相对应的三条主要带：Gli-γ1、Gli-β2和Gli-α3（图1a）。共有120个基因型（58%）含有Gli-γ1和Gli-；78个基因型（38%）仅有Gli-γ1；6种基因型（3%）含有Gli-γ1和Gli-；2种基因型（1%）仅有Gli-γ2（图1b；图S1；数据集S1）。这些结果表明，Gli-γ1和Gli-β2（在较小程度上）是该小麦种质资源中的主要γ-醇溶蛋白变体，而Gli-α3似乎是次要变体。

　　我们使用小麦品种“小偃81”的醇溶蛋白基因编码序列作为查询，在品种Fielder的基因组序列中鉴定醇溶蛋白的基因，并鉴定出44个醇溶蛋白基因，28个编码α-醇溶蛋白，11个编码γ-醇溶素，5个编码ω-醇溶蛋白质。与先前的报告一致，所有γ-醇溶蛋白基因都位于第1组染色体短臂上的Gli-1基因座（图1c）。

　　接下来，我们通过转录组深度测序（RNA-seq）评估了Fielder中γ-醇溶蛋白基因的表达水平，使用授粉后4天（DAP）从整粒种子中提取的总RNA，以及在10、15、20和25 DAP收集的种子胚乳中提取的RNA。γ-醇溶蛋白基因在15–20 DAP时高度表达（图1d），两个基因的转录物TraesFLD1B01G010600和TraesFLD01G005600在20 DAP分别占总γ-醇蛋白转录物的35%和23%（图1e）。

　　图1。小麦种质资源中γ-醇溶蛋白的变异及小麦品种Fielder醇溶蛋白基因的注释。

　　（a） 通过a-PAGE和考马斯蓝染色检测小麦种质资源中γ-醇溶蛋白多态性的示例图片。

　　（d） 基于RNA-seq数据的种子发育过程中Fielder中醇溶蛋白基因的表达模式。

　　为了检查脱靶效应，对三个突变系中其他九个γ-醇溶蛋白基因的编码区进行了测序；这与Fielder（数据集S2）中的野生型（WT）序列相比没有检测到差异。为了评估TraesFLD1D01G005600和TraesFLD1B01G010600对γ-醇溶蛋白积累的贡献，我们使用A-PAGE分析了KO植物T3代和WT种子中的醇溶蛋白水平。WT包含Gli-γ1和Gli-β2，但我们没有在KO-1或KO-2中检测到γ-醇溶蛋白的任何条带（图2c）。在仅在TraesFLD1D01G005600中具有突变的KO-3中，我们检测到Gli-γ2，但没有检测到Gliγ1（图2d）。虽然我们不能排除其他γ-醇溶蛋白基因（图1d）对Gli-γ1生物合成有贡献的可能性，但在三个独立的品系中，TraesFLD1D01G005600功能受损的Gli-β1条带的缺失表明，TraesFlD1D01G005 600是负责Fielder中大部分Gli-α1醇溶蛋白积累的主要基因。因此，我们将该基因命名为Gli-γ1-1D。

　　（b） CRISPR/Cas9在敲除突变株KO-3中诱导突变，仅针对该突变株。“+”表示插入；

　　（c）和（d）通过A-PAGE检测KO系和WT中的γ-醇溶蛋白带，随后进行考马斯蓝染色。

　　尽管我们未能分离出仅影响TraesFLD1B01G010600的敲除系，但上述结果表明，TraesFLD1 B01G01060负责Gli-γ2醇溶蛋白的大部分生物合成。为了验证这一假设，我们使用A-PAGE筛选了小麦品种“农大3672”中产生的甲磺酸乙酯诱变M4群体，并鉴定了一个突变体，名为gli-γ-2，缺少gli-γ2带，但包含典型的gli-β1带（图3a）。我们将该突变体与小麦品种“济麦22”（JM22，含有Gli-γ1和Gli-β2条带）杂交，获得了Gli-α2积累较低的杂合F1种子（图3b）。由gli-γ-2×JM22 F1植物自花授粉产生的223个F2个体对gli-γ2带表型表现出1:2:1（缺失：低：正常）的分离比，表明该表型由影响单个基因座的突变引起。对突变表型纯合子和正常表型纯合子的两个库进行大规模分离分析，然后进行全基因组测序（BSA-seq），使我们能够识别两个亲本系农大3672和JM22之间的单核苷酸多态性（SNPs）。

　　我们观察到位于1B染色体5–17Mb区域内的SNP（包含19893个候选SNP）与随机分离的明显偏差，指向gli-γ-2基因组位置（图3c）。随后，使用1774株植物的较大F2群体中的325株纯合突变体植物，我们将含有gli-γ-2突变的区域缩小到129kb的区间，由标记CS1B5096727和CS1B225983界定（图3d）。该基因组区域包含Fielder参考基因组中的五个注释基因（图3d）。我们对gli-γ-2突变体中的所有五个编码区进行了测序，并将这些序列与Nongda3672和JM22进行了比较，发现只有一个gli-γ-2特有的变化：在TraesFLD1B01G010600翻译起始位点下游286 bp处的C-T突变，导致提前终止密码子（图3e）。在中国春季参考基因组中，等效映射区间包含七个注释的高置信基因。尽管中国春基因TraesCS1B02G010080与Fielder基因TraesFLD1B01G010600同源，但TraesCS2B02G0100800被注释为非翻译区（Ensembl Plants网站）。TraesFLD1B01G010600特异性引物未能扩增中国春天基因组DNA中的产物（图S4）。考虑到这一观察结果以及中国春季Gli-γ2醇溶蛋白带的缺失（图1a），我们得出结论，TraesCS1B02G01800不编码Gli-。总之，这些结果表明，TraesFLD1B01G010600主要负责Fielder中Gli-γ2醇溶蛋白的积累。因此，我们将该基因命名为Gli-γ2-1B。

　　（a） （b）在gli-γ-2突变体及其农大3672细胞（a）和gli-γ-2×JM22植物的F1杂合子（b）中，通过a-PAGE和考马斯蓝染色检测到γ-醇溶蛋白多态性。从一粒种子（50mg）中提取的全面粉用于每个样品（c-e）基于图谱的与gli-γ-2相关的突变鉴定。BSA-seq结果表明，gli-γ-2突变位于1B（c）号染色体的短臂上。注释为醇溶蛋白基因的序列以红色（d）突出显示。FLD1B01G010600中C-T突变的定位导致与Gli-γ2带表型缺失相关的过早终止（e）。

　　3.5同时敲除Gli-γ1-1D 和Gli-γ2-1B可以提高小麦品质，而不影响产量

　　为了分析Gli-γ1和Gli-β2醇溶蛋白对小麦最终使用质量的影响，我们采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定了WT和KO系中谷蛋白和醇溶蛋白的水平。与野生型相比，KO-1和KO-2中γ-醇溶蛋白的含量显著降低（图4a和图S5）。两个KO系积累了显著更多的HMW GS和ω-醇溶蛋白（图4b，c），而α-醇溶素的量仅在KO-1中显著增加（图4d）。与WT相比，KO-2中的LMW GSs的量仅显著增加（图4e）。谷蛋白和醇溶蛋白（而非γ-醇溶蛋白）的增加可能与先前报道的其他谷蛋白的补偿有关（Pang等人，2009年；活塞等人，2011年）。因此，KO-1和KO-2的Glu/Gli比率显著高于WT（图4f）。Glu/Gli比率的增加应积极影响最终使用质量（Barak等人，2013年；Li等人，2020年）。事实上，与WT相比，KO-1和KO-2都表现出SDS沉降量增加（图4g）和面筋指数增加（图4 h），这两者都与高最终使用质量有关，尽管湿面筋和干面筋含量减少（图4i，j）。此外，面团的流变学测试表明，与WT面团相比，KO线制作的面团具有更高的面团稳定性时间和更低的面团发育时间以及软化程度（图4k，图S6）。此外，KO-1面团的粘性小于WT面团（图4l）。

　　我们得出结论，剔除Gli-γ1-1D和Gli-。KO-3的γ-醇溶蛋白含量低于WT。此外，在KO-3中，α-醇溶蛋白、ω-醇溶素和HMW GS的量没有变化，而LMW GS的含量和Glu/Gli比率与WT相比有所降低。KO-3的加工质量特征，包括SDS沉降量、湿面筋含量和干面筋含量以及面筋指数没有改变，表明Gli-γ1-1D敲除本身不会影响最终使用质量。

　　这些发现表明，Gli-γ1-1D和Gli-21-1B冗余地影响最终使用质量。最后，我们发现，与野生型相比，KO-1和KO-2中的各种产量相关性状，包括粒宽、粒长、千粒重和总蛋白质含量，没有受到影响（图S8）。该结果表明，由于Gli-γ1-1D和Gli-β2-1B的敲除，可以提高小麦质量。

　　（a-f）γ-醇溶蛋白（a）、HMW GS（b）、ω-醇溶素（c）、α-醇溶肽（d）和LMW GS（e）的RP-HPLC分析。通过整合色谱图中的相关RP-HPLC峰来估计HMW-GS、LMW-GS和不同醇溶蛋白的总量，并使用结果来估计Glu/Gli比率（f）。

　　（g-l）通过测量不同的参数，包括SDS沉降体积（g）、面筋指数（h）、湿面筋含量（i）、干面筋含量（j）、面团流变学试验（k）和面团粘度（l），来评估小麦粉加工质量。

　　醇溶蛋白氨基酸序列的一个特定的九个氨基酸核心区充当触发CD的T细胞识别的主要抗原决定簇。因此，17个特征良好的CD抗原决定簇的9个氨基酸核心区被用作查询库，以搜索44个注释的Fielder醇溶蛋白中的CD抗原决定簇。这在21个α-醇溶蛋白、10个γ-醇溶素和2个ω-醇溶蛋白质中鉴定了10个CD表位（图5a）。α-醇溶蛋白家族包含四个CD表位：DQ2.5-醇溶-α1、DQ2.5-胶溶-α2、DQ2.5-glia-α3和DQ8-醇溶-β1，这些表位在γ-或ω-醇溶中没有发现（图5a）。仅在γ-醇溶蛋白中发现DQ2.5-胶质-γ1和DQ2.5-醇溶-γ2，而仅在ω-醇溶中发现DQ2.5-胶质-ω2。在γ-和ω-中鉴定了DQ2.5-glia-γ4、DQ2.5-gia-γ5和DQ2.5-gilla-ω1，但在α-醇溶蛋白中未鉴定（图5a）。CD表位的含量通过将醇溶蛋白中的CD表位数量乘以编码醇溶蛋白基因的每千碱基转录片段/百万映射片段（FPKM）表达值来估计。

　　总体而言，在γ-醇溶蛋白中检测到CD表位的主要含量（图5b，数据集S8）。值得注意的是，Gli-γ1-1D和Gli-β2-1B编码富含CD表位的γ-醇溶蛋白，尤其是DQ2.5-glia-γ4变体（图5b，数据集S8）。由于Gli-α1-1D和Gli-γ2-1B占了Fielder生产的大多数γ-醇凝蛋白，因此它们也被认为是Fielder面筋中CD表位数量的主要原因。使用单克隆抗体（mAb）R5方法对KO-1、KO-2和KO-3突变体中的CD表位进行定量评估，该方法作为评估免疫反应肽含量的参考。与WT相比，KO-1、KO-2和KO-3的R5响应性CD表位分别减少了76%、68%和69%（图5c，d）。这一发现表明，Gli-γ1-1D和Gli-β2-1B基因的同时敲除也显著减少了Fielder谷物面筋中CD表位的数量。

　　（a） Fielder基因组中醇溶蛋白基因中CD抗原决定簇含量的估计，根据RNA-seq结果。

　　（c） 使用单克隆抗体R5和竞争性酶联免疫吸附试验检测KO-1和KO-2系以及WT中的免疫反应肽含量。

　　由于Gli-γ1-1D和Gli-β2-1B基因的同时敲除与最终使用质量的提高和CD表位的减少有关，我们在来自中国的206个小麦种质群体（包括159个现代品种和47个地方品种）中探索了Gli-α1-1D和Gli-γ2-1B的自然遗传变异。使用A-PAGE，分别在204份（99%）和122份（59%）材料中鉴定出Gli-γ1和Gli-β2醇溶蛋白带（图S1）。桑格测序用于鉴定Gli-γ1-1D和Gli-β2-1B编码序列中的SNP。对于Gli-γ1-1D基因，发现了八种单倍型，它们代表了四种不同的氨基酸序列，以下称为Gli-β1-I、Gli-α1-II、Gli-γ1-III和Gli-δ1-IV单倍型（图6a，注释S1）。单体型Gli-γ1-III和Gli-；因此，为了进一步分析，我们重点关注Gli-γ1-I和Gli-β1-II，分别占种质的62.4%和35.9%。Gli-γ1-I和Gli-β1-II的差异在于一个具有脯氨酸到丝氨酸取代的错义突变（图6b）。氨基酸变化位于重复和非重复γ-醇溶蛋白结构域之间的连接处。Gli-γ2-1B位于1B号染色体的短臂上。在小麦-黑麦1BL/1RS易位系中，小麦1B号染色体的短臂被黑麦1号染色体（1RS）的短臂取代（Lee等人，1995）。事实上，在缺乏Gli-γ2醇溶蛋白的84份材料中，64份（76%）是1BL/1RS易位系（图S1）。剩余20份缺乏Gli-γ2条带的材料中Gli-β2-1B编码序列的桑格测序表明：i）10个品系具有位于翻译起始位点下游340bp的C-T多态性，导致提前终止密码子；ii）10个株系完全缺乏Gli-γ2-1B基因（图S10）。对含有Gli-γ2条带的122份材料中Gli-β2-1B编码序列的桑格测序确定了12个单倍型，对应于10个不同的氨基酸序列，以下命名为Gli-α2，后跟罗马数字I至X。在具有Gli-γ2条带的材料中，有四分之三（40.6%）含有Gli-β2-IV单倍型，28（26.4%）含有Gli-γ2-I单倍型、11（10.4%）含有Gliγ2-VI单倍型和24（22.6%）含有其他七种单倍型之一（图S10b，数据集S10）。这10个单倍型中的氨基酸取代位于重复的γ-醇溶蛋白结构域、poly-Q结构域或蛋白C末端（图S10c）。

　　HMW-GS被认为是小麦最终使用质量的主要负责人和最终使用质量因素，并且它们在小麦种质中表现出高度的遗传变异。因此，为了评估不同的Gli-γ1单倍型是否与不同的最终使用质量相关，并避免不同HMW-GS谱提供的混杂效应，我们选择了含有Gli-β1-I或Gli-α1-II和相同HMW-GS的材料。我们比较了Gli-γ1-I和Gli-β1-II对SDS沉降值的影响，以估计最终使用质量，结果表明，与含有Gli-α1-II的材料相比，含有Gli-γ1-I的材料具有显著更高的SDS沉降值（图6c）。为了证实Gli-γ1-I单倍型对加工质量的贡献，重组自交系（RIL）是由亲本农大3331（携带Gli-β1-I单倍型）和‘Zang1817’（携带Gliγ1-II单倍型）杂交产生的。Gli-γ1-I单倍型的RIL比Gli-β1-II单倍型株系的SDS沉降值更高（图6d）。在小麦种质收集中，39%的地方品种携带Gli-γ1-I，而70%的现代品种和69%的面包制作质量高的品种携带这种单倍型（图6e）。这些观察表明，Gli-γ1-I单倍型代表了现代小麦育种计划中选择的一种等位基因，因为它与更高的加工质量相关。为了帮助育种者识别和利用Gli-γ1-I单倍型，我们开发了一种有效且易于使用的共竞争等位基因特异性PCR（KASP）标记，其靶向511位的C-T多态性，以区分Gli-β1-I和Gli-α1-II单倍型。然后，我们使用40个含有Gli-γ1-I的小麦种质和40个含有格利-γ1-II的种质验证了我们的KASP标记：我们的标记有效且准确地区分了这两种单倍型（图6f）。Gli-γ2单倍型在本次分析中未被考虑，因为只有122份材料含有Gli-β2条带，其中频率较高的两种单倍型（即Gli-α2-i和Gli-δ2-IV单倍型）和相同的HMW-GS模式代表的材料太少，无法进行可靠的统计分析。此外，Gli-γ2单倍型在现代品种和地方品种中均匀分布（图S10d）。

　　图6。小麦种质资源中Gli-γ1-I单倍型的鉴定，该单倍型与Gli-β1-1D等位基因相关，并与面粉加工质量的提高呈正相关

　　（b） Gli-γ1-I和Gli-β1-II单倍型的Gli-α1醇溶蛋白结构域示意图。这两种单倍型的不同之处在于错义突变导致位于重复性和非重复性γ-醇溶蛋白结构域连接处的残基171处的脯氨酸-丝氨酸取代。

　　（e） Gli-γ1-I和Gli-β1-II单倍型在地方品种、现代品种和面包烘焙品质高的品种中的分布

　　（f） 基于KASP的Gli-γ1-I和Gli-β1-II单倍型检测方法的评估。使用Gli-γ1-I或Gli-β1-II单倍型的一组基因型测试该方法。

　　在这项研究中，我们注释了普通小麦品种‘Fielder’基因组中的醇溶蛋白基因。该品种是用于转化的主要小麦品系，这是RNAi和CRISPR/Cas9方法中的重要步骤。我们在Fielder中鉴定了11个γ-醇溶蛋白基因，并在此证明，其中只有两个基因，Gli-γ1-1D和Gli-γ1-1B起主要作用。通过CRISPR/Cas9生产Gli-γ1-1D和Gli-β2-1B敲除品系提高了最终使用质量，减少了CD表位，而不影响产量，从而为基于生物技术的育种计划提供了宝贵的材料。

　　此外，我们筛选了大量小麦种质资源，以鉴定与更高最终使用质量相关的Gli-γ1-1D单倍型，并开发了一种简单的检测方法。总的来说，这些发现通过基因工程和基于自然遗传变异的经典育种计划，仅针对两种醇溶蛋白基因的功能，对提高最终用途质量做出了相关贡献。

　　最后，鉴定与加工质量相关的Gli-γ1-1D等位基因，并开发一种简单可靠的检测方法，是通过利用自然遗传变异的经典育种计划提高最终用途质量的有用工具。未来的研究应该寻找编码其他独特醇溶蛋白（如α型和ω型醇溶蛋白）的额外的单倍型，用于小麦改良。

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