欧皇平台欧皇注册欧皇登录欧皇官网？合成生物学是一门以工程思想为指导、多学科结合的新兴领域，通过一系列重新设计与技术改造使生物体或细胞具有新的能力，在此过程中设计与构建一系列新的标准化的生物元件、组件与系统，以实现理想的合成生物系统。
该领域在过去十多年的发展中，从设计生物装置、建立代谢通路到合成基因组，大多是在微生物底盘中进行的。但随着研究的深入，简单的单细胞体系已无法满足发展需求，需要向多细胞的复杂体系过渡。植物拥有丰富的内膜系统和细胞器、高度特化的生物合成基因簇、精细的代谢调控网络，为开展相关研究提供了理想的模式体系。以植物为底盘的合成生物学研究（图1），如设计检测环境变化的植物传感器、开发精准修饰的基因编辑技术、建立高效异源合成代谢途径等，不仅有助于人类加深对复杂生命运行规律的理解，还有望为解决农业生产、生物制药、能源环境等方面的困境与难题提供新策略，实现可持续发展。
植物合成生物学通常采用“设计-构建-测试-学习”的研究策略（图2），在学习抽象自然生命系统的基础上，选取底盘植物，并对遗传回路中所涉及的生物元件进行“重编程”，或重头设计具有全新特征的人工生命体系；然后，利用“基因编辑”、“基因合成”等工具，用实验方法来构建，再将构建出来的生物系统转入选定的底盘植物中进行测试，并对获得的结果进行详细分析优化设计，如此反复循环优化，形成正向可靠的科学闭环。
植物合成生物学在“设计阶段”的关键之一是选择合适的宿主生物，即“底盘”(Molina-Hidalgo et al., 2021)。目前已经开发的底盘植物种类包括：烟草、水稻、番茄、拟南芥等多种植物。
烟草作为植物界的“分子生物学工作室”，目前可以实现大量的遗传转化操作，并且该物种有大量公开的基因组、转录组和代谢组资源，使多质粒组合转化、瞬时转化、稳定转化、底盘改进、基因工程改造等技术手段在烟草中得到了充分的发展。通过工程改造的烟草，可作为合成生物学的底盘植物，用于生产大部分重组蛋白如药物、疫苗、激素、细胞因子、生长调节剂和天然产物等（图3）。其中，以烟草作为蛋白质生物制剂（例如：抗体、重组疫苗等）的制造平台已经成熟，目前有两种候选疫苗，即流感和2019冠状病毒（COVID-19），已进入临床试验的高级阶段(Tusé et al., 2020)。
图3 本氏烟草中植物源虾青素合成途径的工程研究(Allen et al., 2022)。（A-C）用于在转基因植物中诱导虾青素生产的载体构建示意图。（D）转化后的T0本氏烟草植物呈现出特有的铜色。（E）烟草中虾青素积累后的颜色比较（左侧转基因植株，右侧野生型）。
水稻作为模式植物，拥有丰富的基因组学、代谢组学、遗传学资源，以及完善的遗传改良技术手段，是合成生物学理想的底盘植物。利用合成生物学的手段不仅可以将水稻改造成高价值的天然产物生产工厂，还可以对水稻的产量、营养品质进行改良和优化。例如，水稻胚乳可作为生产和储存高价值活性物质的生物反应器，用于生产包括药用蛋白、口服疫苗、维生素和黄酮类和类胡萝卜素等营养药品（图4）；将水稻自身的OsGLO3（乙醇酸氧化酶）、OsOXO3（草酸氧化酶）和OsCATC（过氧化氢酶）组合在一起转入水稻中，通过这三种酶在叶绿体中的作用可以将乙醇酸依次完全氧化成CO2，形成一种类似C4植物的光合CO2浓缩机制，从而显著提升水稻的光合效率，生物量、氮含量和籽粒产量等(Shen et al., 2019)。
番茄拥有广泛的遗传资源，其基因组序列已发表，表观基因组、RNA-seq、代谢物数据、数量性状基因座（QTL）、Tomato-EXPEN 2000遗传图谱和突变的表型库等都有良好的系统性数据库。并且，番茄中目标基因的稳定和瞬时表达/沉默方法也有很好的发展。此外CRISPR/Cas9基因组编辑在番茄中也取得了不错的进展。通过设计番茄可作为合成生物的底盘植物用于生产苯丙烷类化合物，辣椒素，甜菜碱，迷迭香酸、视黄醇、维生素、胆固醇以及酮类胡萝卜素等。例如，通过在番茄中上调PAL、KAS、COMT、FaTA这四个基因，以及启动BCAT、CS这两个基因，就可以在番茄中开启辣椒素基因的表达，从而更大量、更高效、更廉价地生产辣椒素（图5）。
拟南芥是目前研究最深入的模式植物之一，其拥有丰富的基因组学、遗传学和生化资源，可供合成生物学家使用。此外，在拟南芥中还存在许多合成途径以及在这种模式植物中异源表达的工具和资源。拟南芥作为合成生物学的底盘植物可用于生产天然产物、检测环境以及合成药物相关的化合物。例如，通过分析评估拟南芥代谢过程，实现了萜烯的高效生产；将荧光锌生物传感器引入拟南芥中，可作为植物传感器来监测易受污染的区域；通过敲除拟南芥中产生硝基自由基的蛋白质基因，拟南芥表现出增强的三硝基甲苯 （炸药，TNT）耐受性，使其可用于爆炸后田间环境的修复。此外，对于初次接触合成生物学的研究者来说，拟南芥是一个很好的学习系统，它可以轻松的进行正向和反向遗传学的研究。并且易于进行遗传转化，通过简单的花浸法即可将含有目的基因的载体转入植物体内。
除了上述的几种植物外，目前还陆续开发出了许多植物底盘生产工厂，如：甜菜素高度积累的马铃薯、茄子和矮牵牛花、富含虾青素的玉米以及其它有前景的植物底盘如杨树、油菜等。小远在此就不一一详细讲解了，大家感兴趣的话可以查阅相关的文献进行阅读。
植物合成生物学的核心思想是基于标准化的生物元件进行工程化改造以获得新型生物功能。在植物中，生物合成元件主要分为三类：（1）催化元件（如氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶等）；（2）转运元件（从胞外向胞内内转运、运输的相关蛋白，如转运蛋白、离子通道蛋白等）；（3）调控元件（如启动子、核糖体结合位点、终止子、转座子、核酸开关、核酸调节子等）。合成元件可以组装成复杂程度不同的合成基因线路，而这些线路又能以新的形式组合成模块，最后这些元件、线路和模块都将运输到植物底盘的细胞中在不同的亚区室进行表达，最终实现对现有植物体系的改造和优化(张博等, 2020)。
随着研究的深入，越来越多的生物元件被鉴定测试，这也为合成生物学的发展奠定了坚实的基础。例如，Feike等人通过系统分析发现pBdEF1α、p35S、pAtUBI10、pOsUBI3、pZmUBI、pBdUBI10和pOsPGD1这7个启动子和t35S、tNOS、tH4、tAdh和tOCS这5个终止子在单、双子叶植物的叶片和根中都有较高的强度，可用来驱动目的基因表达或用于构建多基因复合性状载体(Feike et al., 2019)。Pérez-González等人对烟草、鸡溶菌酶、拟南芥的基质结合区（MAR, matrix attachment regions）和矮牵牛的转化促进序列（Transformation boost sequence, TBS）进行测试，发现上述4种绝缘子序列均能够增强外源基因表达，并且拟南芥MAR序列还能够减小基因表达的变动幅度(Pérez-González et al., 2019)。此外，通过创建植物特异性启动子，获得转录活性更高的精短型的小核RNA启动子，为植物多基因编辑提供了强有力的工具(Hao et al., 2020)。
DNA的合成与组装是合成生物学“构建阶段”中的关键技术。传统的PCR技术可以对已知DNA序列进行合成，但如果要合成的DNA序列未知或是自然界中并不存在的DNA，则需要使用DNA从头合成技术，即寡核苷酸合成。获得DNA片段后需要对其进行组装（图9），常见的体外组装方法主要分为三类：重叠定向组装（如In-Fusion、Gibson组装）、利用噬菌体整合的位点特异性重组（如Gateway克隆）和基于限制性核酸内切酶的策略(Sleight et al., 2010; Gibson et al., 2010; Hartley et al., 2000)。体内组装方法分为两类：由λ-Red重组酶系统介导的同源重组方法和Cre/loxP（如TGS Ⅱ系统）、Flp/Frt介导的位点特异性重组方法(张博等, 2020)。
基因编辑是基因功能分析和作物改良的重要工具。基因编辑技术的发展促进了高效的基因组编辑和基因功能的表征。目前已应用于植物基因编辑的技术包括：锌指核酸酶（ZFN）系统、转录激活因子样核酸酶（TALEN）系统、成簇规则间隔的短回文重复（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统、以及RNA干扰（RNAi）技术等(Mohanta et al., 2017)。其中，CRISPR/Cas9系统因其简单、快捷和高效的特点逐渐成为植物基因组编辑中最常用的技术，其次是CRISPR/Cas12a（Cpf1）系统（图10）。核酸内切酶Cas9和Cpf1通过sgRNA被引导至特定的基因组位点，识别目标DNA序列并完成切割，产生双链断裂的基因组位点，通常通过非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）或同源重组（Homologous recombination，HR），导致基因敲除或替换。对于生物合成中的多个基因或同一通路的调控可以针对不同基因的靶点设计gRNA，采用Golden Gate或Gibson组装方法将多个gRNA序列装配到CRISPR/Cas9双元表达载体中。此外，由诱导型或组织特异性启动子驱动的Cas9的表达可以用于控制特定细胞、组织、发育阶段的基因表达。
近几年，随着单碱基编辑技术的开发，基因编辑领域进入了一个更为精准的时代，目前常见的胞嘧啶碱基编辑器（Cytidine base editors，CBE）、腺嘌呤碱基编辑器（Adenine base editors，ABE）已在水稻、小麦、番茄、玉米、拟南芥等多个物种中实现了应用(邵洁等, 2020)。另外，为了解决单碱基编辑的脱靶问题，Lin等人建立起了适用于植物任意碱基编辑的技术——植物引导编辑技术（Plant prime editing，PPE），并在水稻和小麦的原生质体中实现12种类型、16个位点的精确编辑(Lin et al., 2020)。新型的饱和靶向内源基因突变碱基编辑器（Saturated targeted endogenous mutagenesis editors，STEME）的成功建立，实现了水稻乙酰辅酶A羧化酶基因的定向进化，从而获得除草剂抗性突变，这也为快速获得有益农艺性状提供了可能(Li et al., 2020)。另外，为了避免外源片段整合到基因组中的风险，科学家们还尝试将Cas蛋白和gRNA在体外组装成核糖核蛋白复合体（Ribonucleoprotein，RNP）进行DNA-free的编辑，并已在14种植物中测试成功(Metje-Sprink et al., 2019)。
植物的遗传转化和细胞再生技术开发对于整个植物合成生物学的发展至关重要。在合成生物学的“测试阶段”，合成的遗传回路可以通过多种方法转入底盘植物中，常用的方法包括：核基因组遗传转化、瞬时转化、叶绿体遗传转化。
图11 瞬时（黄色）、核（紫色）和叶绿体（绿色）表达系统的简化示意图(Burnett et al., 2020)。
目前常用的核基因组稳定遗传转化手段主要有农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道遗传转化法、显微注射法和最新的纳米颗粒转化法。其中农杆菌介导的遗传转化方法（图12）已成为双子叶植物和单子叶植物（如水稻）中最常用的基因传递技术，但其转化效率受受体植物、基因型、外植体、载体、细菌菌株以及培养基组成等的影响。最新开发的纳米颗粒转化法是将装载外源基因的纳米粒子，通过基因枪技术或借助磁场等转入植物中，从而获得转基因植株。该技术具有穿透性强、装载量大、保护外源基因不被降解以及较短的遗传转化周期等特点。
图12 根癌农杆菌介导的植物转化过程(Hwang et al., 2017)。（1）根癌农杆菌附着于植物细胞；（2）根癌农杆菌感应植物信号后开始调控毒力基因；（3）T-DNA和毒力蛋白的产生和运输，T-复合物从细菌细胞进入植物细胞；（4）T-DNA和效应蛋白进入细胞核；（5）T-DNA在植物基因组中的整合和表达。
瞬时转化因其操作简单、转化效率高和检测周期短等特点被广泛应用于利用植物底盘生产天然产物。瞬时转化不仅大大缩短了表达系统的开发时间，还可用于测试转基因载体以及快速获得重组蛋白进行功能分析。目前，常用的瞬时转化体系有烟草叶片、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体、毛状根等，关于这一部分内容的详细讲解，大家感兴趣的话可以查阅小远的往期文章：没有转化体系的物种，如何研究其基因功能？（二）。
比起细胞核转基因，叶绿体的转基因具有多重优势，主要包括：1、由于缺乏表观遗传或转录后基因沉默机制，蛋白表达水平高且稳定；2、叶绿体DNA通过母系遗传，几乎不存在转基因不良扩散的风险；3、叶绿体中多为原核性质的转录翻译机制，可以运用多顺反子调控的表达策略等(Kuroda et al., 2001; Ruf et al., 2007; Long et al., 2018)。目前叶绿体的遗传转化一般是通过基因枪法或PEG介导的转化将转基因引入叶绿体基因组中。此外，人们还可以利用脂质交换膜渗透（LEEP）技术，借助纳米颗粒将基因在无外力作用的情况下将DNA运输到植物细胞的叶绿体中。进入叶绿体后，叶绿体的弱酸性环境就会促使DNA从纳米颗粒中释放出来，进而合成相应的蛋白。因为植物细胞一般有几十个叶绿体，所以以叶绿体作为生物反应器可以高效地表达如抗体和口服型疫苗等外源蛋白，还可以创制抗病抗虫抗干旱等非生物胁迫的转基因植物材料。
图13 在植物叶片中使用纳米颗粒靶向叶绿体进而递送pDNA的示意图(Kwak et al., 2019)。
植物及其产生的化合物是我们拥有的重要自然资源。从我们吃的食物到我们服用的许多药物，植物为我们提供了多种能够改善人类健康的生物活性化合物。随着植物合成生物学的迅猛发展，研究人员可以通过设计和改造植物来满足人们更多的需求。例如：（1）合成多样化的生物传感器来监测细胞内的活动；（2）定向改造作物提高产量和丰富营养品质；（3）合成植物天然产物或生物医药；（4）生产生物能源等。关于植物合成生物学的具体应用，今天就简单给大家科普一下，接下来小远会专门搜集资料给大家出一期详细的讲解。
文章至此就告一段落了，本文主要是给大家简单讲解了植物合成生物学的背景以及如何开展合成生物学的策略，相信大家通过阅读本文会对植物合成生物学产生一定的印象，大家如果对这一部分内容感兴趣的话，可以私信或者在评论区留言，小远会搜集资料为大家陆续推出合成生物学的其它文章哦！
